Les tests moléculaires

Le diagnostic des maladies causées par des viroïdes ne peut être assurée par les méthodes sérologiques. On utilise dans ce cas des techniques basées sur l'analyse des acides nucléiques de plantes infectées par électrophorèse en gel de polyacrylamide, ou sur la caractérisation d'acides nucléiques par hybridation moléculaire.

Le recours à l'amplification moléculaire, via la PCR, a permis de reculer les limites de sensibilité des techniques de diagnostic basées sur la détection de séquences spécifiques d'acides nucléiques.

Electrophorèse en gel de polyacrylamide

Ainsi pour le diagnostic de viroïdes, des techniques de diagnostic particulières ont été developpées comme l'analyse des acides nucléiques de plantes infectées par électrophorèse en gel de polyacrylamide.

Dans le cas de virus à ARN, le diagnostic peut se fonder sur le fractionnement des ARN génomiques ou des ARN bicaténaires (dsARN). Les extraits de plantes saines ne contiennent normalement pas de quantités détectables de dsARN ayant une masse moléculaire supérieure à 10^5 daltons. Leur présence indique donc, en principe, qu'elle est infectée par un virus ou agent de type viral. Le dsARN peut représenter le génome d'un virus à ARN bicaténaire ou les formes réplicatives d'un virus à ARN monocaténaire.

La technique d'analyse des dsARN peut être utilisée à partir de faibles quantités de matériel ; elle présente l'avantage d'être applicable sans connaissance préalable du virus en cause, contrairement à la détection par sérologie ou par hybridation moléculaire. (Extrait de Phytopathologie, De Boeck)

L'hybridation

En laboratoire, 2 systèmes froids sont utilisés pour le marquage de la sonde : peroxidase et digoxigenine (hydrolyse d’un substrat qui émet des photons qui viennent imprégner un film radiographique). On peut révéler des dépôts fait en spot ( dot-blot) ou encore pour les virus des empreintes (squash-blot et Tissu-Print Hybridization =TPH).

Par un type de marquage donné, la sensibilité des tests d'hybridation par dot blot se trouve limitée par le nombre de molécules cibles présentes dans l'échantillon à analyser ; la sensibilité de la technique avoisine celle des tests sérologiques quand on utilise des sondes froides.

La réaction de polymérisation en chaîne (PCR)

 Amplification d’un ADN matrice (copie exponentielle) à l’aide de deux amorces qui vont se fixer sur la matrice et une enzyme l’ADN polymérase qui va polymériser. Etape 1, dénaturation 95°C, étape 2 annealing 35-70°C étape 3, extension , 72°C. Phases de dénaturation initiale et extension finale. La PCR a révolutionné le diagnostic.

•  Détection par PCR sur extraits végétaux : la préparation de l’échantillon est critique car il existe des inhibiteurs de PCR. Il faut adapter en conséquence les protocoles d’extraction. L’amplification d’ADN cible se fait directement à partir du végétal.
•  La spécificité et sensibilité dépendent du choix des amorces, de la température d’annealing, du nombre de cycles. Si régions conservées amplifiées, on va amplifier des bactéries d’une même espèce ou genre. Régions moins conservées, on va aller jusqu’au pathovar ou à la souche.
•  Tests très sensibles (106/107 bact/ml). On peut augmenter la sensibilité du test en procédant à une N-PCR

Plusieurs types de PCR peuvent être utilisés :

•  Nested -PCR (N-PCR) :augmentation de la sensibilité du test en procédant à une deuxième amplification sur l’amplifiat 1 avec une paire d’amorce plus interne dans le fragment. Intérêt : Meilleure sensibilité et spécificité

•  Multiplex PCR : dans le cas d’une espèce bactérienne dont on veut détecter toutes les souches et pour lesquelles il existe une certaine variabilité, on est obligé de mettre plusieurs paires d’amorces dans le milieu réactionnel pour allumer toutes les souches (pour couvrir la diversité d’une espèce et pour détecter plusieurs pathogènes en même temps).

• PCR quantitative : 5’nuclease assay

  Méthode utile pour détecter et quantifier en temps réel de l’ADN d’un pathogène donné. Utile pour du diagnostic à grande échelle (utilisé pour l’instant en OGM). Il existe plusieurs systèmes de détection en PCR quantitative :

  •  Syber green : c’est un fluorochrome qui a une affinité pour l’ADN double brin. En solution il est très faiblement fluorescent. Après l’amorçage des primers il se lie à l’ADN double brin et l’émission de fluorescence commence. La qualité de fluorescence va être proportionnelle à la quantité d’ADN double brin néosynthétisé. Efficace mais peut il y avoir des problèmes de spécificité puisque s’insère dans n’importe quelle molécule d’ADN double brin néoformé.
  •  Taqman : méthode plus spécifique, elle utilise une sonde spécifique de l’ADN cible mais aussi 2 amorces complémentaires de l’ADN cible. Lorsqu’il y a polymérisation, la polymérase synthétise de l’ADN, elle a en même temps une activité exonucléasique en 5’ qui va « attaquer la sonde ». Sur cette dernière, 2 fluorochromes, un quencher et un reporter sont présents. Le quencher empêche l’émission de fluorescence par le reporter. Une fois séparé du quencher, le reporter va émettre de la fluorescence. Plus d’ADN polymérisé, plus de fluorescence.

•  Real- time PCR